שאלון מערכת: שיעורי בית מולקולרית 1

הסבר: במה השאלה עוסקת: אנזימים בתהליך השכפול.

תשובה ג’. האנזים הליקאז (Helicase) מבצע פירוק של קשרי מימן מסוג Base-pairs אשר נמצאים בין נוקלאוטידים מקבילים ב-DNA. כלומר, הוא “פותח” את מבנה ה-Double helix של הדנ”א ומאפשר את היפרדות הדו-גדילים לשני חד-גדילים. בכללי, ה-DNA helicase בנויים בצורת טבעת הקסמרית מ-6 תתי-יחידות זהות שכל אחת מהן פועלת כ-ATPase אשר משמש לשינוי קונפורמציה בתת-היחידה שגורם לתנועת האנזים על גדיל ה-DNA. בפרוקריוטים ההליקאז (שנקרא DnaB) נע על הגדיל מכיוון 5′ ל-3′ שבמהלך השכפול (Replication) גדיל זה נקרא הגדיל המתעכב (Lagging strand). כמו כן, באאוקריוטים ההליקאז (שנקרא Mcm) נע בכיוון 3′ ל-5′ שמתפקד כגדיל המוביל (Leading strand). ההליקאז פועל לא רק בתהליך השכפול אלא גם בתהליכים רבים נוספים כגון בתהליכי תיקון דנ”א רבים (DNA repair), ברקומבינציה הומולוגית (Homologous recombination) כ-RuvB ובתהליך השעתוק (Transcription) כחלק מפקטור השעתוק TFIIH.

שלילת מסיחים:

א’. אקסונוקלאז הינו אנזים, ולעיתים חלק מאנזים, אשר מפרק את הקשרים בין הנוקלאוטידים שבתוך גדיל הדנ”א. קשרים אלו הם קשרים קוולנטים מסוג פוספודיאסטר (Phosphodiester) אשר נמצאים בין הבסיסים החנקניים של אותו חד-גדיל. אקסונוקלאזים מסוג 3′ ל-5′ ,אשר נמצאים על ה-DNA polymerase למשל, משמשים כחלק ממנגנון ה-Proofreading שלו לתיקון טעויות זיווגי בסיסים שהתרחשו במהלך תהליך השכפול. אנזימים אלו אינם מפרקים קשרי מימן מסוג Base-pairs ולכן תשובה זו אינה נכונה. 

ב’. כפי נאמר מעל, אקסונוקלאזות מפרקות קשרים קוולנטים מסוג פוספודיאסטר, גם אקסונוקלאזות מסוג 5′ ל-3′ אשר נמצאות למשל על זנב ה-RNA polymerase ומשמשות לפירוק גדיל הרנ”א שמסונתז לאחר שעתוק רצף הטרמינציה עד לסיום פעילותו של ה-RNA polymerase, אינן מפרקות קשרי Base pair ולכן תשובה זו אינה נכונה גם כן.

ד’. האנזים גיראז (Gyrase) הוא אנזים פרוקריוטי מסוג Topoisomerase type II אשר יוצר פיתולים שליליים (Negative supercoil) בדנ”א. אנזים זה משתמש בשני ATP על מנת ליצור שני שברים בגדיל ה-DNA, הקשרים שגיראז שובר הם גם קשרים קוולנטים מסוג פוספודיאסטר (כמו אנזימי האקסונוקלאזות). 

להרחבה – Alberts, מהדורה שביעית, ע”מ 261-262 (DNA helicase), עמוד 259 (5′ to 3′ exonuclease)  ועמוד 337 (Gyrase).

הסבר: התשובה הנכונה– ב׳ 

Alberts עמ 202.- מהדורה 7

שלילת מסיחים:

מסיח א׳ אינו נכון- אנו יודעים שהיסטוני הליבה מסונתזים בשלב S של מחזור התא ווריאנטים של היסטונים מסונתזים במהלך האינטרפאזה.

מסיח ג׳- להיסטון H3 יש מס׳ ורייאנטים שיש להכיר- Alberts; Figure 4-36

מסיח ד׳ – רק לאאוקריוטים יש היסטונים.

הסבר: תשובה ד׳.

משפחות גנים הן  משפחות של גנים דומים/קשורים (related) באותו הגנום. לשלוש ממלכות העל – ארכיאה, בקטריה ואאוקריוטים, יש יותר מ200 משפחות גנים משותפות (שלילת מסיח ב׳). השאלה מתייחסת לטבלה והנתון בסעיף ד׳ מופיע שם- ישנן 63 משפחות גנים הקשורות בתרגום ומשותפות גם לבקטריה גם לארכיאה וגם לאאוקריוטים. יש רק 2 משפחות המשותפות לכולם וקשורות בחלוקה תאית ומחזור התא (שלילת מסיח ג׳). והמשפחה הנפוצה ביותר, כמו שכבר אמרנו – תרגום, שייכת לתחום של עיבוד מידע (כך מגדיר הספר) ולכן סעיף א׳ אינו נכון.

להרחבה-  Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 20-22, ו – Table 1-1ֿ

הסבר: תשובה ד. במה עוסקת השאלה: Telomerase.

תשובה ד. הטלומראז (Telomerase) הוא אנזים אאוקריוטי מסוג ריבונוקלאופרוטאין (Ribonucleoprotein) אשר אחראי על הארכת הטלומרים (Telomers) בקצה 3′ בכרומוזומים. בעזרת פעילות זו, הטלומראז נותן מענה לבעיית הקצוות (Endreplication problem) אשר מתרחשת באאוקריוטים עקב אי יכולתו של הפולימראז בסינתזת קצוות הכרומוזום. הטלומראז מכיל גדיל רנ”א מסוג lncRNA אשר ממנו הוא מסנתז רצף חוזרני של GGGTTA בקצה 3′ של הכרומוזום, הארכת הקצה מאפשרת ל-DNA polymerase להמשיך ולהאריך את קצה 5′ של הכרומוזום. יצירת גדיל DNA על בסיס תבנית של RNA נקראת RNA dependent DNA polymerase אשר כזכור קיימת גם באנזימיה-Reverse transcriptase, ולכן תשובה זו היא הנכונה.

הערת המחבר – כאשר חלה ירידה בפעילות אנזימי הטלומראז או בכמותם בתא, הטלומרים יתקצרו לאחר כל תהליך שכפול, דבר שיחשוף אותם לנזקים אפשריים. כאשר יתרחש נזק כזה התא יפעיל מנגנוני עצירה למחזור התא (cell cycle arrest) אשר ימנעו הכפלה נוספת. תופעה זו נקראת “Replicative cell senescence” והיא מתארת את “הזדקנות” התא. התקצרות זו של הטלומרים יכולה להתרחש גם בדרכים לא טבעיות, למשל במחלת Dyskeratosis congenita,  שבה אחד מהגנים שממנו משועתק רצף תבנית ה-RNA של הטלומרז עבר מוטציה כלשהי אשר מונעת את פעילותו. אנשים הסובלים ממחלה זו יהיו בעלי טלומרים קצרים ויחוו תסמיני זקנה מוקדמים כגון פיגמנטציה של העור, שחמת בכבד וכשל במוח העצם מכיוון שאלו תאים בעלי Cell cycle מאוד מהיר ותדיר.

שלילת מסיחים:

א׳ ישנם המון סוגים של רצפים חוזרניים (Repeated sequences) לאורך הכרומוזום, למשל רצפי LINE, SINE, Satellite וכדומה. הרצפים החוזרניים של הטלומר (GGGTTA) אינם נמצאים לכל אורכו של הכרומוזום אלא רק בקצוותיו, מכיוון שזהו רצף מיוחד אשר מושך אליו חלבון שנקרא Shelterin שהווה כשכבת הגנה נוספת לקצוות הכרומוזום כנגד נזק אפשרי.

ב׳ רצף הטלומר החוזרני משתנה מאוד בין אורגניזמים שונים, אך ללא ספק הוא אינו עשיר בזיווגי בסיסים שלאדנוזין-טימידין (AT-rich), למשל באורגניזם האאוקריוטי Tetrahymena הטלומר מכיל GGGGTTG או כפי שהודגם מעל, בבני אדם הרצף בטלומר הוא GGGTTA (אשר מכילה 50% רצפי AT-rich). הסבר אפשרי לשכיחות הנמוכה יותר(לרוב) של AT-rich בטלומר טמונה בחוזק קשר גבוה יותר בזיווג הבסיסים של GC אשר מוסיף עוד שכבת הגנה לקצוות הכרומוזום.

ג׳ כפי שנאמר,לטלומראז פעילות של RNA dependent DNA polymerase, כלומר הוא מסנתז דנ”א מתבנית של רנ”א, ולכן תשובה זו אינה נכונה.

להרחבה– Alberts, מהדורה שביעית, ע”מ 281-283 (Telomerase).

הסבר: במה השאלה עוסקת: בועית שכפול

תשובה ד׳:  האיור מדגים את הקונפורמציה שמתקבלת בעת תהליך השכפול של הכרומוזום כאשר שני הגדילים מופרדים בעזרת אנזימי הליקאז (Helicase) והתקדמותם לכיוונים מנוגדים. מבנה זה נקרא בועית השכפול  (Replication bubble)  אשר מורכבת משני מזלגות שכפול (Replication forks). את מבנה זה ניתן לראות בפרוקריוטים (במיקום יחיד שבו נמצא ה- Origin) ובאאוקריוטים (בכל ה-Origin שפרושים לאורך כל הכרומוזום) כאחד. נושא הכיוונים של אנזימי השכפול מאוד מבלבל ועל מנת לפשטו צריך לזכור פרט חשוב – כל סוגי הפולימראזות מסנתזות לכיוון של 5′ ל-3′ (כלומר מוסיפות נוקלאוטידים חדשים בקצה 3′ בכל פעם), ולכן הם נעות וקוראות את גדיל התבנית בכיוון ההפוך – מ-3′ לכיוון 5′. כאשר זוכרים זאת, התשובה כבר ידועה, בנוסף לזאת על מנת שהפולימראז יתחיל לסנתז הוא צריך פריימר (Primer) שממנו הפולימראז מתחיל להוסיף נוקלאוטידים לקצה 3′. ולכן בכל פעם שיש פריימר עם רצף מסוים – הפריימר יהיה בקצה ה-5′ שלו כי הפולימראז חייב להאריך את הרצף בקצה 3′. באיור שבשאלה, ניתן לראות כי הפריימרים נמצאים בקצה 3′ של הגדיל הבת (הגדיל החדש שמסונתז) ולכן זו הטעות באיור.  

שלילת מסיחים:

א׳. גדיל האב (Parental strand) הם הגדילים המקוריים שעל פיהם הפולימראז מסנתז את גדילי הבת (Daughter strand), אשר נקראים גם גדילי התבנית (Templet strand). גדילים אלו מקבילים אחד לשני, כלומר קצה 3′ של גדיל אחד יהיה מקביל לקצה ה-5′ של הגדיל השני, ולכן כפי שניתן לראות באיור כיוונם של הגדילים תקין.

ב׳ מקטעי האוקזאקי (Okazaki fragments) הם המקטעים שנוצרים בגדיל המתעכב (Lagging strand) עקב הכיווניות של הפולימראז, בכל מזלג שכפול יש גדיל מתעכב אחד וגדיל מוביל אחד (Leading strand). הגדיל המוביל יהיה זה שיתקדם לעבר הכיוון שמזלג השכפול מתקדם (כלומר הפולימראז נע לאותו כיוון שההליקאז נע באותו מזלג) והגדיל המתעכב הוא הגדיל אשר מסונתז לכיוון הנוגד את התקדמות מזלג השכפול (כלומר הפולימראז “מתרחק” מההליקאז). ולכן כפי שניתן לראות המיקום של מקטעי האוקזאקי בגדיל המתעכב נכונים, אומנם המיקום של הפריימר בתוכם לא, אך הם נכונים, ולכן תשובה זו אינה הנכונה.

ג׳ שכפול חיידקי (פרוקריוטי) הוא גם שכפול דו-כיווני כמו באאוקריוטים. מספר סוגי וירוסים משכפלים בצורה חד-כיוונית (Unidirectional) את הגנום החד-גדילי שלהם (DNA או RNA), תהליך זה נקרא “Rolling circle replication”. בתהליך זה, הפולימראז מתחיל לשכפל בנקודת ה-Origin את הגנום ומבצע מספר “סיבובים” על החד-גדיל כאשר בסופו של התהליך מגיע אנדונוקלאז (Endonuclease) שמבצע חיתוך במספר מקומות בגדיל הארוך החדש למקטעי גנום קצרים יותר. שיטת שכפול זו יעילה מאוד מכיוון שהיא מהירה ומספקת מספר תוצרים בכל פעם.

להרחבה– Alberts, מהדורה שביעית, ע”מ 256-258 (DNA replication)

 במה השאלה עוסקת: Griffith’s experiment.

תשובה ד‘. הניסוי של גריפית’ (Griffith’s experiment) היה אחד הניסויים הראשונים שחשפו את תהליך הטרנספורמציה (Transformation) של החיידקים. בתהליך זה נעשית העברה של הגנום החיידקי לסביבה וממנה לחיידקים אחרים ללא מגע ישיר ביניהם. גריפית’ הראה שהחיידקים הלא אלימים (חיידקי R מסוגלים לקבל את הגנום שמכיל את הגנים שמחוללים את מחלת דלקת הריאות (Pneumonia) מחיידקים מתים (חיידקי S),  ע”י החדרת חיידקים לא-אלימים (R) חיים + חיידקי אלימים (S) מתים לעכברים. החיידקים הלא אלימים קיבלו את הגנום מחולל המחלה ע”י טרנספורמציה מהחיידקים האלימים שמתו וכך רכשו את היכולת לגרום לדלקת ריאות. ולכן תשובה זו היא הנכונה.

שלילת מסיחים:

א’. כפי שנאמר מעל, העכברים מתו עקב חיידקי ה-R אשר רכשו את יכולת הפתוגניות. בנוסף לזאת, לא ידוע על מנגנון שמחזיר לחיים אורגניזמים שמתו, כך שצריך ישר לשלול תשובה זו.

ב’. אכן היה ניתן לבודד חיידקים מסוג S חיים מרקמת העכברים מכיוון שחלק מחיידקי ה-R נהפכו לאלימים ורכשו את צורת ממברנת החיידקים האלימים שהייתה חלקה (S=Smooth), אך תשובה זו אינה נכונה מכיוון שחיידקי ה-S הורגים את העכברים עקב דלקת הריאות שהם יוצרים.

ג’.מסיח זה מנסה לבלבל בין תהליך הטרנספורמציה, שמתאר העברת מידע גנטי דרך הסביבה, לצורת תהליך השכפול (Replication) .

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 184-185

    במה השאלה עוסקת: Okazaki fragments.

תשובה ג. מקטעי אוקזאקי (Okazaki fragments) מתארים את קטעי ה-DNA שסונתזו במהלך תהליך השכפול (Replication) בגדיל המתעכב (Lagging strand). מקטעים אלו אינם רצפים, זאת לעומת המקטע הארוך שמסונתז בגדיל המוביל (Leading strand) מכיוון שהכיווניות של הגדיל המתעכב הפוכה לכיוון התקדמות מזלג השכפול (לחילופין, מנוגדת לכיוון תנועתו של האנזים Helicase) ולכן היא מתקדמת במקטעים (בכל פעם ההליקאז חופש עוד אזור שמתחיל להיות מסונתז וכן הלאה). מקטעים אלו נמצאים גם בפרוקריוטים (באורך של 1000-2000 נוקלאוטידים) וגם באאוקריוטים (באורכים של 100-200 נוקלאוטידים). כמובן שמקטעי אלו מסונתזים מקצה 5′ לקצה 3′ מכיוון שהפולימראזות (כל סוגי הפולימראזות ללא יוצא מן הכלל!) מסנתזות מכיוון 5′ ל-3′.

הערת המחבר – אחד ההסברים המעניינים להבדל שבין אורכי מקטעי האוקזאקי בפרוקריוטים לאאוקריוטים נעוץ בנוכחותם של הנוקלאוזומים (Nucleosomes) שאחראיים לדחיסת הגנום האאוקריוטי אשר נמצאים במרווחים של 200 נוקלאוטידים לאורך הכרומוזום. כאשר הדנ”א פולימראז דלתאDNA (polymerase δ)  שאחראי על סינתזת הגדיל המתעכב מגיע לנוקלאוזום הוא נעצר ולכן אינו מסוגל להמשיך. 

שלילת מסיחים:

א . בגדיל המוביל לא יווצר מקטעי אוקזאקי מכיוון שהוא המשכי והדנ”א פולימראז “רץ” עליו ללא הרבה עצירות ולכן אינו מכיל מקטעים קצרים. זה נובע מהסנכרון בכיוון תנועתם של הפולימראז וההליקאז (כלומר הפולימראז עם כיוון פתיחת מזלג השכפול).

ב . בהמשך לנ”ל, מקטעי האוקזאקי (וכן שום סינתזת DNA או RNA) אינה יכולה להתרחש מכיוון 3′ ל-5′ (כלומר שסנתזת נוקלאוטידים חדשים בקצה 5′ בכל פעם), זאת עקב יכולתו של הפולימראז לסנתז רק בכיוון 5′ ל-3′.

ד .כאשר מבינים את כיוון פעולת הפולימראזות, חשוב לא להתבלבל או למהר במסיחים כאלו, ולשים לב לא ליפול במסיחים כאלו שבאים להטעות. אם הכיווניות מבלבלת מעט, אפשר פשוט להשקיע כמה שניות ולצייר זאת על מנת להיות בטוחים. 

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 260-261

התשובה הנכונה- ב׳. הסבר: זו דוגמה לשאלה של משפט הלקוח מכותרת כחולה בספר וזה פשוט מה שכתוב. בחלק זה, הספר מסביר לנו שבניגוד למה שאנחנו עלולים לחשוב, כלל היצורים החיים היום מאחסנים את המידע הגנטי שלהם בצורה של דנ״א דו-גדילי. שימו לב- הכוונה היא ליצורים חיים ולכן אין התייחסות לוירוסים שכמובן בעלי סוגים שונים של גנומים.

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 2-3

תשובה א. כאשר מתייחסים למבנה ההליקס הדו-גדילי (Double Helix) של ה-DNA ההתייחסות היא למבנה השניוני (Secondary structure) שלו, כלומר לצורה הדו-ממדית שהמולקולה רוכשת. לרוב, מבנים שניוניים מתבססים על קשרי מימן (Hydrogen bonds) כמו במבנים שניוניים בחלבונים. כמשתמע משמו, קשר המימן הוא קשר כימי הנוצר בין אטום מימן לבין אחד מאטומי ה-NOF (חנקן, חמצן ופלואור, בהתאמה), קשר זה הוא קשר קוטבי המאפיין לרוב קשרים בין מולקולריים. בדנ”א, קשרי מימן אלו נוצרים בין בסיסים מסוג פירמידינים (Pyrimidines) לבין בסיסים מסוג פורינים (Purines), אחד בצורת טבעת חנקנית אחת והשני בנוי משתי טבעות חנקניות, בהתאמה. בין הבסיס החנקני מסוג פורין שנקרא אדנין (Adenin) לבין הבסיס החנקני מסוג פירימידין שנקרא טימין (Thymine) נוצרים 2 קשרי מימן. וכן, בין הפורין גואנין (Guanine) לבין הפירימידין ציטוזין (Cytosine) נוצרים שלושה קשרי מימן (ולכן זיווג הבסיסים האחרון מעט חזק יותר.(

שלילת מסיחים:

ב . קשר יוני (Ionic bond) הוא קשר הנוצר בין יונים בעלי מטען שונה, כלומר בין אניון (יון חיובי) לקטיון (יון שלילי). קשר זה נוצר עקב משיכה אלקטרוסטטית בין היונים, בהקשר הדנ”א לרוב נראה קשרים מסוג זה בהקשר מתכות שונות, כגון במבנה ה-Zinc finger של פקטורי שעתוק (Transcription factors)– בין יון האבץ לבסיסים ב-Major groove.

ג . קשרים קוולנטים (Covalent bonds) נמצאים בעיקר במבנים ראשוניים (בחלבונים ובחומצות גרעין כאחד), קשרים אלו חזקים מאוד ודרושים לשמירת מבנה הבסיס של המולקולה. בהקשר הדנ”א קשרים קוולנטים מחברים בין הבסיסים החנקניים שנמצאים באותו חד-גדיל, אשר שם הם נקראים קשרים פוספודיאסטרים (Phosphodiester bonds). קשרים אלו מחברים בין אטום פחמן בבסיס חנקני אחד לאטום פחמן בבסיס צמוד ע”י אטום של פוספט.

ד . קבוצת סולפהידריל (Sulfhydryl group) היא אטום גופרית (S) אשר מחובר לאטום מימן (H), קבוצה זו יכולה להתחבר לקבוצת סולפהידריל נוספת וליצור קשר דיסולפידי (S-S) שהוא קשר מאוד חזק שמאפיין בעיקר מבנים שלישוניים (Tertiary structure) בחלבונים! מכיוון שקשרים אלו מתפרקים מהר בנוכחות פרוטונים (ולכן נמצאים בעיקר בסביבות חוץ תאיות שכן בתא יש הרבה פרוטונים). קשרים אלו אינם משתתפים בזיווגי הבסיסים ולכן מסיח זה אינו נכון.

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 3-5

במה השאלה עוסקת: DNA ligase.

תשובה ג . אנזימי הליגאזות (Ligase) הם אנזימים אשר מחברים יחד שתי מולקולות ע”י שימוש באנרגיה. האנזים דנ”א ליגאז אחראי לחיבור 2 מקטעי דנ”א, או ליתר דיוק – 2 נוקלאוטידים, יחדיו ע”י יצירת קשר פוספודיאסטרי (Phosphosiester bond). פעילות זו מבוצעת ע”י פירוק ATP ל-AMP ודי-פוספט חופשי, הראשון מחובר לקצה 5′ הפנוי של אחד הנוקלאוטידים אשר הופך את ריאקציית החיבור למועדפת אנרגטית (Energetically favorable). החיבור עצמו של הניק (Nick) נעשה בצורה ספונטנית בזכות ה-AMP שבקצה 5′. הדנ”א ליגאז פועל באינספור מצבים כגון בתהליכי תיקון שונים (DNA repair), שיבוט דנ”א (DNA cloning) ובשכפול (Replication). באחרון, פעילותו של הליגאז תתרחש בעיקר בגדיל המתעכב (Lagging strand) שבו ישנה נוכחות גבוהה של מקטעים לא רציפים אשר נקראים מקטעי אוקזאקי (Okazaki fragments). אומנם, גם בגדיל המוביל (Leading strand) נראה פעילות של דנ”א ליגאז אך בצורה מאוד מצומצמת מכיוון שבגדיל זה הדנ”א שמסונתז רציף יותר.

שלילת מסיחים:

א’. כפי שנאמר מעל, רוב האנזימים מכיל כחלק הנומנקלטורה שלהם את תיאור פעילותם, כלומר כאשר נראה אנזים ששמו מכיל אתה מושג ליגאז, ניתן ישר להסיק כי תפקידו קשור בחיבור 2 מולקולות יחדיו בעזרת מטבע אנרגיה כלשהו (יכול להיות גם ATP וגם NADH). האנזימים אשר מסנתזים פריימר רנ”א מנוקלאוטידים נקראים Primase, ולכן מסיח זה אינו נכון.

ב’. הריאקציה של הארכת הטלומרים (Telomers) נעשית ע”י פולימראז ייעודי שנקרא טלומראז (Telomerase),  אנזים זה איננו מסוג ליגאז ולכן תשובה זו אינה נכונה.

ד’.פעולת פתיחת הגדילים ממבנה ה-Double helix לשני חד-גדילים נעשית ע”י אנזים מיוחד שנקרא הליקאז (Helicase) אשר מבצע שבירה של קשרי המימן בין הבסיסים המקבילים בגדילים בעזרת ATP. גם אנזים זה פועל בתהליך השכפול אך הוא איננו מבצע פעילות של ליגאז (כלומר יצירת קשרים) אלא להפך – שבירה של קשרים. ולכן מסיח זה אינו נכון.

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 260-261

השאלה עוסקת: Origin of replication.

תשובה ג . מקור השכפול (Origin of Replication) הוא אזור בכרומוזום שממנו מתחיל תהליך השכפול, הן באאוקריוטים והן בפרוקריוטים. עקב ההבדל הגדול באורך הגנום בין אאוקריוטים לפרוקריוטים, לאאוקריוטים יש מספר רב של Ori לעומת הפרוקריוטים שמסתפקים ב-Ori יחיד. מעצם חשיבותו של אזור זה הוא מבוקר בצורה הדוקה מאוד ע”י מספר רב של חלבונים, אנזימים ופקטורים שונים. 

הערת המחבר – מושג קריטי בהקשר מקור השכפול שחשוב להכיר הוא “Refractory period”. מושג זה מתאר את תקופת הזמן שבה ה-Ori מעוכב ואינו יכול לעבור הפעלה מחדש. עיכוב זה מאפשר מניעת הכפלה נוספת בזמן תהליך ההכפלה. רק כאשר תהליך ההכפלה מסתיים ה-Refractory period יגמר ויתאפשר תהליך נוסף של שכפול. בחיידקים, תהליך עיכוב זה מתאפשר ע”י עיכוב ה-Initiator protein שנקרא dnaA , אשר אינו מסוגל להתחיל לפעול כאשר רצף ה-GATC חצי ממותל (HemiMethylated). החלבון שמונע את פעילותו של dnaA נקרא SeqA, והוא התנתק מהדנ”א רק כאשר הדנ”א יעבור מתילציה מלאה ע”י האנזים DNA methylase (נקרא גם Dammethylase).

שלילת מסיחים:

א’. כפי שנאמר מעל, רק פרוקריוטים מאופיינים ב-Ori יחיד מכיוון שהגנום שלהם קצר יחסית. מקור שכפול זה מאופיין ברצף שעשיר ב-A-T אשר יפתח בעזרת חיבור מולקולות dnaA לאזור Upstream ייעודי ב-Ori. לאחר מכן, dnaC יטען את dnaB (הליקאז) על אזור ה-A-T . ולבסוף dnaG (פרימאז) יתחבר גם ל-Ori על מנת לאפשר ל-DNA polymerase להתחיל לסנתז.

ב’. שכפול מלא של כל הגנום של פרוקריוטים לוקח בממוצע כ-30 דקות (עם Ori יחיד), אם לאאוקריוטים היה רק מקור שכפול אחד תהליך השכפול היה אורך כ-35 ימים לכרומוזום. על מנת לקצר זמן לא סביר זה ישנם עשרות אלפים של מקורות שכפול המופעלים בו-זמנית. ולכן מסיח זה אינו נכון.

ד’. מקור שכפול יחיד, ספציפי וקבוע נראה רק בחיידקים. אומנם גם באאוקריוטים מקורות השכפול הם ספציפיים וקבועים אך הם רבים.

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 273-277

התשובה הנכונה- ג׳. מסיבות שונות הקשורות לתהליך האבולוציה, קשה—ואולי אף בלתי אפשרי—לקבוע בוודאות מה היה מכלול הגנים הקדמוני שממנו צמחו מגוון צורות החיים הקיימות היום. עם זאת, ניתן לגבש אומדן גס באמצעות ספירת משפחות גנים המיוצגות במגוון מינים (גם אם לא בכולם) משלושת הדומיינים העיקריים של החיים.- ארכיאה, בקטריה ואאוקריוטים. 

בניתוח אחד מסוג זה, נמצאו 264 משפחות גנים עתיקות ומשומרות, שלכל אחת מהן יוחס תפקיד על סמך הגן המוכר ביותר באותה משפחה. המספר הגדול ביותר של המשפחות הללו מעורב בתהליכי תרגום (translation), וכן במטבוליזם ובהובלה של חומצות אמינו. חשוב להדגיש שקבוצה זו של משפחות גנים משומרות מייצגת רק מתווה גס של הירושה המשותפת לכל צורות החיים המודרניות.

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 21-22. טבלה 1-1

תשובה ג.  ה-DNA,  בנוי מ-2 חד-גדילים המחוברים ביניהם באמצעות Base pairing. כל חד-גדיל הוא המשלים לחד-גדיל שממלו, אך בכיווניות הפוכה. לכל אחד מהם יש קצה 3′ (3′ end) וקצה 5′ (5′ end) אשר נקראים כך מכיוון שבקצה אחד ישנו הידרוקסיל (Hydroxyl) על פחמן 3′ בבסיס החנקני האחרון ובקצה האחרישנו הידרוקסיל על פחמן 5′ בבסיסי החנקני, בהתאמה. מולקולות הידרוקסיל אלו יכולות ליצור קשרי פוספודיאסטר (Phosphodiester) עם בסיסים נוספים.

שלילת מסיחים:

א’. אכן שני הקצוות של ה-DNA הפוכים אחד לשני בקצה 3′, אך כפי שנאמר מעל, הכיווניות של החד-גדילים היא הפוכה לכל אורכו – ולא רק בקצה 3′. ולכן מסיח זה איננו נכון.

ב’. האנזים שבונה את הפריימרים (Primers) נקרא DNA primase, הוא בונה פריימרים בכיווניות של 5′ ל-3′ (כיווניות הזהה לכל סוגי הפולימרזות). ה-DNA primase אינו בונה את הפריימרים ספציפית בקצה 3′ של ה-DNA אלא לכל אורכו (בעיקר ב-Lagging strand, ומעט מאוד ב-Leading strand), ולכן מסיח זה אינו נכון.

ד’. מסיח זה מנסה לבלבל עם קצה 5′ של גדילי ה-RNA שבנוי משלושה נוקלאוטידים (Nucleotides) מסוג גואנין (Guanine). כזכור, במהלך תהליך השעתוק (Transcription) באאוקריוטים, ישנם 3 אנזימים שונים המתיישבים על זנב ה-CTD (C-terminal domain) של ה-RNA polymerase II ומתחילים לייצר את ה-5′ Cap. ולכן לא צריך נוקלאוטידים מקבילים בגדיל התבנית (Template strand) על מנת לייצרו.

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 3-5

התשובה הכונה- ב׳.

עוד דוגמה לשאלה הלקוחה מכותרת כחולה. למידע הגנטי של תאים איאוקריוטיים יש מוצא משולב- מארכאון אנאירובי קדום ומחיידקים שאותם אימצו התאים (התיאוריה האנדוסימביוטית). רוב המידע הגנטי הזה מאוחסן בגרעין, אך כמות קטנה נשארת בתוך האברונים שהתפתחו מהחיידקים שנלכדו- המיטוכונדריה ובתאי צמחים ואצות גם בכלורופלסטים. כאשר מפרידים את ה-DNA המיטוכונדריאלי ואת ה-DNA הכלורופלסטי מה-DNA הגרעיני ומרצפים אותם בנפרד, מגלים שהגנומים המיטוכונדריאלי והכלורופלסטי הם גרסאות מצומצמות של הגנומים החיידקיים המקוריים: בתא אנושי, למשל, הגנום המיטוכונדריאלי מורכב מ-16,569 זוגות נוקלאוטידים בלבד, והוא מקודד 13 חלבונים ומערך של 24 מולקולות RNA המעורבות בסינתזת חלבונים.

גנים רבים החסרים במיטוכונדריה ובכלורופלסטים לא נעלמו לגמרי; במקום זאת, הם עברו מהגנום של האנדוסימביוטים אל תוך ה-DNA שבגרעין התא המארח. כך, ב-DNA הגרעיני של בעלי חיים יש גנים רבים המקודדים לחלבונים החיוניים לתפקוד המיטוכונדריה, ואילו בצמחים ובאצות מצויים גנים רבים ב-DNA הגרעיני המקודדים לחלבונים הנחוצים לתפקוד הכלורופלסטים. בשני המקרים, רצפי ה-DNA של הגנים הגרעיניים הללו עדיין מציגים עדויות ברורות למוצאם החיידקי.

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 27-29.

תשובה ד.  ה-DNA בנוי בצורה כזו שהנוקלאוטידים (Nucleotides) נמצאים עמוק יותר במבנה המרחבי של ה-Double helix וחיצונית יותר נראה את השלד הפוספו-סוכרי (Sugar-phosphate backbone) שמחזיק אותם. כזכור, הפוספט הוא האטום שמקשר בין הסוכרים (ה-Deoxyribose או ה-Ribose במקרה של RNA) בקשר קוולטני חזק שנקרא פוספודיאסטר (Phosphodiester bond). לאחד מאטומי החמצן שעל הפוספט יש מטען שלילי אשר מקנה לכל השלד הפוספטי הזה מטען כללי שלילי. על מנת שחלבון יקשר ל-DNA הוא צריך להיות בעל מטען חיובי, כלומר עליו להכיל שיירים חיוביים של חומצות אמינו כגון ארגינין (Arginine), ולכן תשובה זו היא הנכונה. ראוי לציין כיגם להיסטונים (Histones) שבונים את הנוקלאוזומים יש אחוז גבוה שלחומצות אמינו חיוביות מסוג ארגינין וליזין (Lysine).

שלילת מסיחים:

א’. טירוזין (Tyrosine) היא חומצת אמינו פולרית עם קבוצת הידרוקסיל (OH) בשייר שלה. קבוצת ההידרוקסיל אינה נוטהליצור קשרים עם אטומים שליליים. ולכן מסיח זה אינו נכון.

ב’. חומצת האמינו אלאנין (Alanine) אינה יכולה ליצור קשרים יונים בעזרת השייר שלה מכיוון שאינה מכילה מטען חשמלי (חיובי או שלילי). ולכן מסיח זה אינו נכון.

ג’.חומצת האמינו גלוטמט (Glutamate) היא חומצת אמינו חומצית (Acidic) בעלת מטען שלילי, אשר בהכרח אינה יכולה ליצור קשר יוני עם מולקולה שלילית נוספת.

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 186-187

תשובה ב. יכולת ההגהה (Proofreading) ב-DNA polymerase היא היכולת שלו לתקן זיווגי בסיסים שגויים שסונתזו על ידו. כאשרהאנזים מחבר נוקלאוטיד חדש בקצה 3′ החשוף אשר אינו תואם לנוקלאוטיד שנמצא מולו בגדיל התבנית (Template strand) הוא מעביר את הגדיל מאתר הפילמור (Polymerization site) לאתר קטליטי (Editing site) אשר בו מתבצעת פעילות ה-Proofreading, אתר זה דורש קופקטור של מגנזיום (Mg2+) לפעילותו. פעילות זו היא פעילות אקסונוקלאזית (Exonuclease), כלומר ה-DNA polymerase מצבע חיתוך בקצה הגדיל (לכן Exo) ומוציא את הנולקאוטיד השגוי. יכולת זונקראת גם Exonucleolytic proofreading,והיא נעשית בכיוון של 3′ ל-5′ , ולכן תשובה זו היא הנכונה.

שלילת מסיחים:

א’. על מנת לבצע פעילות של הגהה (Proofreading) האנזים נדרש להוריד את הנוקלאוטיד השגוי. פעילות פוספטאזית (Phosphatase) היא יכולת של אנזימים להוריד אטום פוספט בעזרת חיתוך הידרוליטי (Hydrolytic cleavage). הורדת הפוספט מהנוקלאוטיד השגוי לא תתרום לתיקון השגיאה בזיווגי הבסיסים שה-DNA polymerase עשה, ולכן תשובה זו לא נכונה. כזכור, פעילות פוספטאזית ניתן למצוא באנזימים כגון alkaline phosphatase (שמשמש בשיטת ה-Indirect immunocytochemistry), Calcineurin (ביותא – מפעיל את הפקטור NFAT) וכדומה.

ג’. פעילות אקסונוקלאז מכיוון של 5’ל-3′ אינה מאפשרת תיקון בסיסים כיכולת תיקון עצמית של ה-DNA polymerase, מ כיוון שהאנזים מסנתז בכיוון זה (מוסיף נוקלאוטידים חדשים בקצה 5′) ולכן אינו יכול לחתוך את מה שמולו (כי אין מולונוקלאוטידים). 

ד’. יכולת אנדונוקלאזית (Endonuclease) היא יכולתו של האנזים לחתוך חומצות גרעין (Nucleic acid) בקשר שמחבר ביניהם – קשר פוספודיאסטרי (Phosphodiester bond). גם יכולת זו אינה רלוונטית ל-DNA polymerase מכיוון שהוא נדרש לבצע הגהה בזמן אמת כאשר ברגע נתון הוא סנתז את הנוקלאוטיד השגוי ובאותו הרגע הוא נדרש לפרקו. האנזים אינו יכול לחזור אחורה לאמצע הגדיל ולחתוך שם.

להרחבה– Alberts, מהדורה שביעית, ע”מ 258-260 (Proofreading), 572-573 (Indirect immunocytochemistry).

התשובה הנכונה- ב׳. משמאל לימין: DnaA – נקשר ל OriC על ידי זיהוי רצפים ספציפים בDNA, מערער את יציבות הדאבל הליקס ומייצר בועית שכפול. DnaC – חלבון מטען (Loader) אליו יקשר ההליקאז (DnaB) ויטעין אותו על גבי הDNA. לבסוף DnaG הפרימאז יטען גם הוא ויסנתז את הפריימר.

שלילת מסיחים:

תשובה א’. שימו לב שהתשובה נכתבה בסדר הפוך משנתבקשנו בשאלה. (מימין לשמאל)

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 273-274 

התשובה הנכונה- ד׳. מודיפיקציות על היסטונים אכן משנות את מבנה הכרומטין. ישנן כל מיני מודיפיקציות, חלקן פותחות את הכרומטין, חלקן דוחסות אותו. במקרה של טרי מתילציה על ליזין בעמדה 27 על היסטון H3, יגוייס קומפלקס – Reader-writer אל ההיסטונים, קומפלקס PRC2, והכרומטין יסגר וייווצר הטרוכרומטין. 

שלילת מסיחים:

א.  לא נכון, אנחנו לא יכולים להגיד בהכרח שלא יקרה שום דבר מפני שאנחנו יודעים שיש מתילציות שכן משנות את מבנה הכרומטין.

ב. לא נכון- זה יקרה כאשר תהיה טרי מתילציה על ליזין בעמדה 9 של היסטון  H3.

ג. לא נכון. HP1- יגרום לסגירת הכרומטין והיווצרות הטרוכרומטין. 

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 210-212

תשובה ד‘. ישנם 4 נוקלאוטידים עיקריים ב-DNA : גואנין (Guanine), אדנין (Adenine), ציטוזין (Cytosine) וטימין (Thymine). נולקאוטידים אלו נחלקים ל-2 סוגים לפי הבסיסים החנקניים (Nitrogenbase) שלהם – פורינים (Purines) אשר בנויים מ-2 טבעות חנקניות ופירמידינים (Pyrimidines) שמכילים טבעת חנקנית אחת. הפורינים (אדנין וגואנין) נקשרים לפירמידינים (ציטוזין וטימין) בגדיל המקביל ע”י קשרי מימן (Hydrogen bond). בהקשר לשאלה, כאשר נתון שהנוקלאוטיד G (גואנין) מהווה כ-31% מכלל הגנום, ניתן להסיק כי נראה נוקלאוטידים מסוג ציטוזין (C) בכמות זהה – גם 31%. יחד הם מהווים כ62% מכלל הגנום. מה שמשאירכ-38% לשאר הנוקלאוטידים (A ו-T). ומכיוון ששניהם גם נמצאים בכמות זהה בגנום (נקשרים אחד לשני), ניתן להסיק כי כל אחד מהם יהיו בנפח של 19% מכלל הגנום (38% לחלק ל-2). ולכן תשובה זו היא הנכונה.

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 186-187

תשובה א.  הטלומראז (Telomerase) הוא אנזים אאוקריוטי אשר אחראי על הארכת הטלומר בקצוות הכרומוזומים. לקראת סוף תהליך השכפול (Replication) הפרימאז (Primase) לא יכול עוד לשים פריימרים (Primers) בקצה 3′ (כי הגדיל קצר מידי) ולכן ללא פעולת הטלומראז הגדיל היה מתקצר במעט בכל הכפלה (מה שגורם בסופו של דבר לאיבוד מידע ול”הזדקנות” התא). הטלומראז הוא אנזים מסוג רוורס טרנסקריפטאז (Reverse transcriptase) אשר מסוגל לסנתז DNA על בסיס תבנית RNA (נקרא RNA dependent DNA polymerase). האנזים בנוי מחלק חלבוני ומגדיל RNA שיוצר את רצף הטלומר TTAGGG,  לרצף זה מתחברים חלבונים מיוחדים שנקראים Shelterin אשר יוצרים בו את מבנה ה-T-loop ומגנים עליו.

שלילת מסיחים:

ב. החלבון DnaA הוא חלבון פרוקריוטי שמתחבר ל-Origin בשלב האינציאציה (Initiation) של השכפול ופורם את הגדילים באזור ה-AT rich על מנת לאפשר להליקאזות (Helicases) להתחבר ל- DNA. 

ג החלבון- TBP, שמו המלא -TATA Binding Protein, הוא חלק בפקטור השעתוק הכללי (General transcription factor)  שנקרא TFIID אשר מתחבר ל-TATA box ומאפשר את התחלת השעתוק באאוקריוטים. זהו אומנם גם חלבון שמתחבר ל-DNA אך במיקום שונה לגמרי ובתהליך שונה (שעתוק ולא שכפול), ולכן מסיח זה אינו נכון. נלמד עליו בהרחבה בשיעור מולקולרית 3. 

ד. ה-Cdc6 הוא חלבון שקשור לשלב האינציאציה בהכפלת אאוקריוטים.

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳  282.

תשובה נכונה- ב׳. על פי זיווג בסיסים, G=20%, C=20%. נשאר 60 אחוז שמתחלקים שווה בשווה בין A ל – T , כל אחד 30 אחוז. ניתן לפסול את ד’ משום שנתון תא הומני, דהיינו סליל כפול של DNA בו מתקיימים זיווגי בסיסים. תשובה זו הייתה נכונה לו היה נתון גדיל בודד.

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 185-186

תשובה ד‘. פעילות ה-Proofreading של הדנ”א פולימראז (DNA polymerase) היא יכולתו לתקן טעויות של זיווגי בסיסים שגויים שהוא עושה. לפי הערכות הפולימראז מבצע בממוצע כטעות זיווג אחת לכל 10^10 נוקלאוטידים, ובזכות יכולת ה-Proofreading מספר זה אף גבוה יותר. יכולת זו היא פעילות אקסונוקלאזית מכיוון 3′ ל-5′ (3′ to 5′ exonuclease), כלומר היא מבצעת חיתוך הידרוליטי (Hydrolytic), כלומר ע”י מולקולת מים, לנוקלאוטיד האחרון בקצה הגדיל. ולכן ביצוע ה-Proofreading איננו דורש שום מטבע אנרגיה.

שלילת מסיחים:

א’. החלבון DnaB הוא ההליקאז (Helicase) הפרוקריוטי אשר פועל בתהליך השכפול (Replication). הוא בנוי מ-6 תתי-יחידות זהות שכל אחת מהן מסוגלת להשתמש במולקולת ATP על מנת לנוע הדנ”א ולהפריד אותו לשניחד-גדילים נפרדים.

ב’. כשהדנ”א נפתח במזלג ההכפלה, נוצרים פיתולי על חיוביים קדימה למזלג ההכפלה, ופיתולי על שליליים אחורה למזלג. את פיתולי העל מתירים אנזימים ממשפחת הטופואיזומראזות. טופואיזומראז מסוג  1 (Topoisomerase I) – מבצע ניק בגדיל יחיד ואינו דורש ATP. טופואיזומראז מסוג 2 (Topoisomerase II) – מבצע שבר דו גדילי ודורש 2 מולקולות ATP. תשובה ד’ יותר מדוייקת ולכן היא התשובה הנכונה.

ג’. מסיח מעט מבלבל כי במחשבה ראשונה כאשר הדנ”א פולימראז מחליף את הפריימר (Primer) של ה-RNA  הוא איננו משתמש ב-ATP, אך צריך לזכור שגם DNA ligase פועל לאחר מכן והוא משתמש ב- ATP ולכן פעילות החלפת הפריימרים אכן דורשת אנרגיה.

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳  274, 269-270, 259-261

תשובה ב. יש מוטציות שמקדמות התפתחות של סרטן ע״י שינוי מבנה הכרומטין (שלילת מסיח א׳). הן עושות זאת ע״י השפעה על החלבונים שקוראים (Reader), כותבים (Writer) או מוחקים סימני היסטון , או ע״י שינוי קומפלקס ה-Chromatin Remodeling.  

היסטונים הם חלבונים נפוצים מאוד, ויש להם עותקים רבים של גנים שמקודדים אותם. לכן,  כדי שבאמת נראה אפקט של מוטציה עליה להיות דומיננטית ומתעלה על כמות ההיסטונים הרגילים. מוטציה רגילה שפשוט קורית, תשנה כ10% מההיסטונים ולכן על המוטציה להיות דומיננטית (שלילת מסיח ד׳).  מוטציות “אונקו־היסטון” כאלה מופיעות בכ־4% מכלל הגידולים, ובחלק מסוגי הסרטן הן מהוות מנוע עיקרי לתהליך הסרטני.

דוגמה חשובה היא המוטציה שמשנה את החומצה האמינית ליזין בעמדה 27 בהיסטון H3 למתיונין  (H3K27M).  מוטציה זו נמצאת כמעט תמיד בסוג קטלני של גידול מוח בילדים (DIPG), ולעיתים גם בסרטן דם חריף (AML) ובמלנומה אצל מבוגרים (שלילת מסיח ג׳). החוקרים גילו ש־H3K27M  נקשרת באופן חזק וחריג לקומפלקס החלבונים PCR2, ובכך משנה את הרמה של סימון H3K27me3 בכל הגנום. ממצא זה מדגיש עד כמה הטרוכרומטין חשוב לשליטה בביטוי הגנים.

להרחבה-  Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳  215-217.

תשובה ג׳. HARs, הם רצפי DNA משומרים שהצטברו בהם שינויים בקצב יוצא דופן בבני אדם,  כרבע מהם גנים הקשורים להתפתחות המוח. הרצפים שהיו משומרים מאוד ברוב היונקים, אך עברו “צבירה מהירה במיוחד של שינויים בנוקלאוטידים” בבני אדם וחושבים שהם מבטאים תכונות שחשובות מאוד להבדלים בינינו לבין שימפנזות (שלילת מסיח א׳).

שלילת מסיחים:

ב. ה-HARs אינם רצפים שנמחקו מהגנום האנושי; הם השתנו, לא נעלמו.

ד.  ה-HARs אינם מקטעים גדולים שאינם משתנים; הם משתנים משמעותית בבני אדם בהשוואה ליונקים אחרים.

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 238-239

התשובה הנכונה- ב׳.  משפחת גני הגלובין מספקת דוגמה מצוינת לאופן שבו הכפלת DNA יוצרת חלבונים חדשים, וההיסטוריה האבולוציונית שלה נחקרה בצורה יסודית במיוחד. הדמיון החד-משמעי בהרכב חומצות האמינו ובמבנה בין הגלובינים המודרניים מרמז על כך שכולם התפתחו מאותו גן אב קדמון משותף, גם אם כעת חלקם מקודדים ע״י גנים המרוחקים זה מזה בגנום של יונקים. אצל הדו־חיים לדוגמה, הצפרדע  (Xenopus) אשכולות ה־α־גלובין וה־β־גלובין נמצאים על אותו כרומוזום. לעומת זאת, בעופות וביונקים הם על כרומוזומים נפרדים. הסיבה לכך היא, אירוע טרנסלוקציה כרומוזומלית שהתרחש אחרי שהשושלת של העופות והיונקים נפרדה מזו של הדו־חיים, וכתוצאה מכך הופרדו האשכולות לשני כרומוזומים שונים.

להרחבה- Alberts, מהדורה שביעית, עמ׳ 241-242